Y染色體微缺失試劑盒

[產品名稱]

Y染色體微缺失檢測試劑盒(Y6

[規格] 20次測試/

[檢測原理]

Y染色體上存在影響精子發生的無精子因子(AZF)座位缺失,是男性原發性不育的一個重要遺傳因素。AZF基因家族有AZFa、AZFb、AZFc三個區域,其中任何一個區域的微缺失都能導致精子生成障礙。Y染色體微缺失分子診斷實驗利用多重聚合酶鏈反應(multiplexPCR)特異性擴增Y染色體AZF區域的序列標簽位點(STS),每個區域設置2STS位點,AZFa:sY84,sY86;AZFb: sY127,sY134;AZFc:sY254,sY255;以SRY作為內參對照。擴增產物用電泳或雜交等方法進行檢測。

[試劑組份]

組成成分

體積

I反應液

160ul

II反應液

160ul

主反應液

240ul

正常對照

10ul

陰性對照(女性DNA

10ul

ddH2O

1ml


[儲存條件及有效期]

試劑盒保存條件:-20度保存。試劑盒有效期為6個月。試劑盒使用時應盡量減少凍融次數。

[樣本要求]適用樣本:外周靜脈血、上皮、精子和生殖腺活檢標本等。

本試劑未配有DNA提取試劑,本試劑檢測所需DNA模板量為40ng~150ng,建議根據檢測需要量以及DNA提取試劑盒說明書要求,取足量樣本用於DNA提取。標本DNA模板提取正常情況下,A260/280的比值應在1.8~2.0之間。

[試驗過程]

1.取出試劑盒各組分,室溫溶解。根據當次實驗所進行的反應次書計算,反應數指標本檢驗數量加上1個空白對照,1個正常對照、1個陰性對照,剩餘的試劑放回-20度避光保存。


2.按照以下反應體係:

I反應

 

II反應

I-F

4ul

 

II-F

4ul

I-R

4ul

 

II-R

4ul

主反應液

7ul

 

主反應液

7ul

模板DNA

50ng

 

模板DNA

50ng

ddH2O

補充至25ul

 

ddH2O

補充至25ul

total

25ul

 

total

25ul

I反應:檢測的STS位點SY84、SY127、SY255

II反應:檢測的STS位點SY254、SY134、SY86

模板DNA是指:標本DNA、陰性對照、正常對照、空白對照

備注:PCR反應中不能加入loading buffer。

 

 

 

3.反應條件

反應條件

反應時間

反應循環數

94

60Sec

 

94

30Sec

35cycle

56

90Sec

72

90Sec

72

10min

 


4. PCR擴增後檢測

PCR擴增產物最常見的檢測方法是瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物加入loading buffer 4ul。然後瓊脂糖凝膠電泳。由於每個泳道有4條擴增產物,其分子量相差太小,電泳時間將可相應的延長,但是電泳時間控製在1時以內比較合適。推薦:取PCR反應產物10ul進行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖濃度3%,電壓選擇8V/cm,電泳時間45~60min。


5. 實驗結果的判斷與優化

I

產物大小

區域

II

產物大小

區域

SRY

472bp

 

SRY

472bp

 

sY84

346bp

AZFa

SY254

380bp

AZFC

sY127

274bp

AZFb

SY134

301bp

AZFb

sY255

126bp

AZFc

SY86

166bp

AZFa

擴增條帶辨別示意圖:
  
 

所有男性標本中都應擴增出SRY條帶,若待測樣品中無此帶,提示實驗失敗,需檢查DNA抽提是否成功,或者擴增操作是否正確。陰性對照、空白對照沒有上述對應的條帶擴增,若出現小於100bp擴增,則為二聚體。正常對照每個反應出現4條帶,如果與正常對照相比出現一個或者多個STS條帶缺失,即可判斷為其對應的STS缺失。

注:AZFc缺失是最常見的缺失類型。若AZFc區域的sY254sY255出現單個缺失,通常是實驗錯誤所致。如試劑設計不合理、標本保存或DNA抽提有問題。AZFa區域的兩個STS位點出現單個缺失非常罕見,在排除實驗操作失誤後,判斷為AZFa區域的部分缺失,但得出結論前應仔細複核。AZFb區域情況類同。

[備注]  此試劑盒僅供科研使用。

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